药物筛选 | 林旭东/李洪林/史鹏团队联合研发用于高通量筛选组合药物的“斑马鱼胶囊”
多药联合疗法（使用多种药物联合治疗，来提高治疗效果和降低副作用的方法）被广泛用于许多疾病的临床治疗，包括中枢神经系统（CNS）疾病【1-4】。鉴于这类复杂疾病的治疗通常需要与生物系统的调节相结合【3】，在对大型组合化合物库进行高通量筛选来寻找新药时，往往需要一个合适的体内功能平台。但由于在技术和成本上的困难，此前对体内组合药物筛选的报道却十分罕见。
2022年1月27日，中山大学生物医学工程学院/广东省传感技术与生物医学仪器重点实验室林旭东团队、华东理工大学药学院/上海市新药设计重点实验李洪林团队和香港城市大学深圳研究院生物医学工程系史鹏团队合作，在AdvancedScience上发表题为Fish Capsules: ASystem for High‐Throughput Screening of Combinatorial Drugs的文章。研究团队利用“超限制造”上海市市级重大专项的飞秒激光技术等微制造技术，首次展示了基于微流控芯片及凝胶技术的斑马鱼自动封装技术，结合微液滴阵列，开发了一种基于斑马鱼自动化封装技术和微滴阵列策略的新型斑马鱼胶囊系统（Fish Capsule, FC），实现了斑马鱼幼虫的大规模定向固定和复合平行添加功能。结合生物信息学分析和机器学习算法，该系统成功地用于单药/多药疗法的体内高通量功能筛选。
为了实现高通量、高内涵、多功能筛选，研究团队从现有的Microdroplet阵列技术出发，开拓了动物定向固定（用以获取大范围的多器官成像）、特定器官功能分析和大规模筛选应用三大功能，得到了斑马鱼胶囊（FishCapsule, FC）系统（图1）。该系统开创了夹心法平行添加化合物在体内活性组合药物筛选中的应用。此外，为了进一步提高FC系统在实际筛选应用的通量，该12×8的阵列系统也与工业标准的96孔板相兼容。
图1. 能够实现高通量、高内涵、多功能筛选的斑马鱼胶囊（FC）系统
FC系统运行后，研究人员根据功能和形态标准对36条幼虫进行了48小时的健康评估。结果表明，实验组（被筛选的幼虫）和对照组（在培养皿中自由移动的动物）在心跳、血流率或形态上并无显著差异。随后又对FC系统和手动嵌入方式进行了对比，发现在前12小时的幼虫形态异常分别为0％和2.8±2.5％。在48小时评价后，FC系统释放的动物的存活率（91.7±3.4％）比手动嵌入组（61.1±5.1％）高得多（图2），FC系统释放后的幼虫运动表现也与对照组无异（图3）。为了进一步验证该技术的生物相容性，研究人员又进行了48小时毒性试验，与对照组相比，在FC系统中的幼虫中没有明显的损伤（图4）。这些结果表明，FC系统能够迅速、安全地对斑马鱼幼虫进行定向封装，这为进一步体内大规模筛选打下了良好的基础。
图2. FC系统定向斑马鱼和手工嵌入斑马鱼的健康评估结果比对
图3. FC系统释放后幼虫的行为测试
图4. FC系统内幼鱼在48小时毒性试验后的健康评估
为了验证FC系统的功能，研究人员首先评估了16种临床使用的中枢神经系统药物对斑马鱼幼虫大脑活动的影响，其结果用T-score BAM（大脑活动显著性分数）表示。T-score BAM结果表明，大多数药物会引起大脑活动的急性变化。为了进一步提取所有T-score BAM之间的内在一致性，研究人员应用主成分分析（PCA）来降低维度和噪声，然后采用基于层次聚类的共识聚类方法来剖析基于主成分（PC）的表型多样性。本研究确定了四个最佳表型T-score BAM类别。其中，1类、2类和4类三个T-score BAM类别与药物的治疗类别具有统计学相关性，包括抗抑郁药(N06)、抗癫痫药(N03)和抗精神病药(N05)。这些结果表明，FC系统可以应用于神经活性药物的单一疗法筛选（图5）。
图5. 使用FC系统，基于斑马鱼大脑活动图谱对CNS类药物进行分类
接下来，研究人员又使用FC系统评估了9种被报道会对心脏细胞产生影响的药物。在FC系统中，这些药物确实会引起斑马鱼心脏功能的急性变化。为了定量分析动物在一段时间内的心跳，这里使用了心跳波动指数（HBFI）作为药物对心率的影响指标。为了深入解析药物治疗后的心脏活动，研究人员又从频率、相位和幅度方面分析了原始信号，还提取了原始记录中具有代表性的信号包络，用以表示药物在心脏中的体内动态反应。来自快速傅里叶变换（FFT）的峰值幅度直方图和频谱图还显示了某些药物特有的心脏信号特征。基本上，FC系统可以根据HBFI（时域特征）、包络（幅度域特征）和FFT模式（频域特征），为每种药物对心脏功能的治疗效果提供体内指纹（图6）。
图6. 基于无标记指纹的心脏药物高通量筛选
为了进一步证明该系统在研究组合药物相互作用方面的功能，研究人员将神经活性化合物和心脏药物的组合并行加载到FC系统中，分析它们对斑马鱼心脏活动的影响。定性和定量分析结果表明，在药物联合使用后，氯氮平和舍曲林等神经类药物对心脏的副作用大大降低。与此同时，这些组合药物的T-score BAM与对应的CNS药物T-score BAM具有极高的相似性（图7）。总体而言，这些组合化合物能够在保证药效的同时，降低单一用药的副作用。也就是说，FC系统能够筛选出合适的组合化合物，为药物联合使用提供指导。
图7. 使用斑马鱼胶囊（FC）系统的大规模药物联合试验。
原文链接
https://doi.org/10.1002/advs.202104449
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校稿：李洪林
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